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新品推薦*一種可減少組織切片自發熒光的新技術

高效減少組織自發熒光 ——提高免疫熒光分析中的信噪比  

 免疫熒光技術是現代生物學和醫學中的常用的一種實驗技術。該方法靈敏度高,可使用熒光顯微鏡對組織樣本進行分析。該技術利用熒光分子標記的抗體對與之相結合的抗原進行定位,可對蛋白質、聚糖蛋白、小生物分子和非生物分子進行清晰的亞細胞可視化研究。但是,組織中的自發熒光往往會嚴重干擾這一技術的發展。如這篇文章所述,目前,已經研發出一項技術,其可顯著降低組織的自發熒光,提高染色結果的信噪比。

 自發熒光是指在免疫熒光檢測過程中產生的與目的信號無關的、背景熒光信號的統稱。組織切片中的紅細胞(RBCs)和膠原蛋白等成分可產生很強的自發熒光,其嚴重影響目的信號的辨別。此外,組織固定中使用的福爾馬林、多聚甲醛等物質也能產生大量的自發熒光。

 組織產生的自發熒光對組織切片的檢測結果造成了很大的困擾,尤其對使用綠色和紅色通道熒光的檢測。盡管目前的技術手段已經避免了紅色/遠紅外波長產生的自發熒光,但某些情況下,在600-700nm波長范圍內仍然可能產生組織的自發熒光。

 組織自發熒光產生的原因主要來自于組織本身的組分。主要包括黃素、卟啉、植物葉綠素、膠原蛋白、彈性蛋白、紅細胞和脂褐素等。這些組分通常在可見光譜的綠色和黃色波長范圍內產生熒光。而免疫熒光技術中最常用的熒光染料是綠色波長通道的熒光素和Alexa Fluor 488。組織中這些天然成分發出的自發熒光顯著影響實驗結果的信噪比。

 除去組織切片自身的原因,組織固定中經常使用的甲醛、戊二醛和福爾馬林等也會造成組織的自發熒光。由于固定劑本身造成的高背景熒光,許多使用福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)的組織樣品,尤其是腎臟/脾臟的組織樣本,非常不適用于免疫熒光檢測。這是由于福爾馬林可在藍色、綠色和紅色波長光譜范圍上產生大量的自發熒光。

目前,關于由組織固定導致自發熒光顯著增加的機理尚不清楚。甲醛和戊二醛均可通過形成共價交聯來穩定組織結構。由于與醛反應的蛋白側鏈種類繁多,反應動力學、可逆性以及交聯劑復雜的化學性質使得產生交聯的化學結構各異。這可能也是導致自發熒光機理尚不明確的主要原因之一。

確定減少自發熒光的技術方法

FFPE組織中產生的自發熒光很可能是由于C = C鍵或C = N鍵的存在。為了解決這一問題,有些研究,利用硼氫化鈉來還原C = C和C = N鍵以減少組織的自發熒光。然而,硼氫化物和與之類似的還原劑在中性pH環境下很不穩定。研究人員發現,盡管硼氫化鈉可成功的減少組織中的一些自發熒光,但該方法的可重現性低、試劑處理難度很大。

 用于減少組織自發熒光的另外一種方法是光漂白。使用該方法時,組織切片長時間暴露于高強度UV輻射下,組織中的成分發生不可逆的光氧化作用。有研究證明,光漂白與其他處理結合使用可有效的降低自發熒光。但該方法耗時太長。另外,大多數免疫組化實驗室均缺乏光漂白方法所需的儀器設備。

 歷史上,用于降低組織自發熒光的主要方法是用蘇丹黑或類似的非熒光重氮染料溶液處理組織。這些疏水染料可與組織切片進行非特異性結合,結合后的染料(蘇丹黑)通過吸收入射光來降低組織的自發熒光(暗淬滅)。

 具體來說,蘇丹黑對降低組織中由脂褐素引起的自發熒光非常有效。脂褐素是一種很明亮的熒光色素,在一些組織中隨著年齡的增長而積累。脂褐素顆粒由溶酶體消化的脂質殘基組成。由于蘇丹黑的疏水特性,其能有效地結合富含脂質的脂褐素顆粒并掩蓋其產生的自發熒光。但是,蘇丹黑對醛固定、結締組織和紅細胞產生的自發熒光效果較差。


 新技術

目前,一種減少組織切片自發熒光的新技術已經應運而生。該方法可顯著減少由于福爾馬林固定、膠原蛋白、彈性蛋白和紅細胞導致的自發熒光。這項新技術以Vector? True VIEW? Auto fluorescence Quenching Kit形式銷售。該技術使用親水性的水溶液處理組織切片,可靜電結合膠原蛋白、彈性蛋白和紅細胞。此外,這種無熒光、帶負電的水溶性分子也能有效地結合組織中的福爾馬林,包括結腸、胰腺組織、前列腺、扁桃體、脾臟、腎臟、膽囊和胸腺等組織。

  一旦結合,TrueView淬滅劑便可顯著降低組織中的自發熒光。這種試劑很可能通過靜態和暗淬滅機制相結合的方式來降低組織中的自發熒光。

 由于TrueVIEW Quencher的親水性特征,組織切片的處理也是在水溶性緩沖液中進行的,因此并不需要70%乙醇預處理步驟。 此外,在免疫熒光實驗結束時,只需使用TrueVIEW Quencher處理兩分鐘即可。更重要的是,TrueVIEW淬滅劑可與常見的大部分熒光基團兼容,例如熒光素、Alexa熒光劑、DyLight熒光劑、Cyanine熒光劑以及綠色熒光蛋白等。

 TrueView Quencher處理方法的實用性已在脾臟組織(Fig1A和1B)和胰腺組織(圖1C和1D) 的實驗結果中得到證實。未經處理的脾臟組織,在綠色通道中發生了很強的自發熒光,這些自發熒光嚴重干擾了Ki67的信號(圖1A)。經TrueView Quencher處理后,在黑色背景中,可清晰看到Ki67的亮綠色的目的信號(圖1B)。此外,圖1還證明了使用TrueView Quencher處理胰腺組織的有效性:經處理后,組織中綠色和紅色波長處的自發背景熒光大大降低(圖1C和1D)。 圖2證實了TureView Quencher可降低腎組織中綠色和紅色自發背景熒光,并可保證其正常的DAPI(藍色通道)核染色。



圖1. 顯著降低的自發熒光可揭示靶抗原的真正定位。上圖A、B為人脾臟(FFPE)組織染色結果: 使用anti-Ki67(綠色)和anti-CD20(紅色)。 (A)未經任何處理;(B)經TrueVIEW處理;上圖C、D為人胰腺組織染色結果:使用anti-Insulin(綠色)和anti-END(紅色)。(C)未經任何處理;(D)經TrueVIEW處理。


圖2.減少綠色和紅色通道的自發熒光。使用DAPI對經抗原修復的人腎臟組織(FFPE組織)進行核染色。綠/藍通道:(A)未經任何處理,(B)經TrueVIEW處理。 紅/藍色通道:(C)未經任何處理,(D)經TrueVIEW處理。

目前,針對可以降低組織自發熒光產品的擔憂主要是使用其處理組織后對目的信號(通常是熒光基團連接的二抗)產生的影響。理想情況下,可以達到降低組織中的自發熒光而不影響二抗熒光信號的目的。

 使用TrueVIEW Quencher處理組織后,自發背景熒光顯著減少。同時也會對其二抗熒光造成一定的損失??賞ü褂酶吲ǘ瓤固澹ㄍ?)或延長曝光時間來彌補這一影響。綜合考慮,在大多數免疫熒光檢測中,使用Vector True VIEW Autofluorescence Quenching試劑

可顯著提高整個實驗結果的信噪比。


圖3.抗原修復的人腎臟(FFPE組織)染色結果:使用anti-AE1 / AE3(綠色)標記。(A)未經處理 (B)經TrueVIEW處理。 一抗濃度增大2倍可實現最佳的信噪比(圖B)。A圖中的箭頭部位代表B圖中去除的自發背景熒光。

總結

在發展擴大的免疫熒光技術領域,現在已經開發出一種新穎的方法,該方法操作快速、簡單實用,并可用于具體嚴重自發熒光的FFPE標本。該方法在基于組織的免疫熒光檢測中具有廣泛的應用,并可與標準熒光和共聚焦激光顯微鏡的激光相兼容。Vector? True VIEW? Auto fluorescence Quenching Kit產品詳情請致電029-68816309。




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